- سبد خرید شما خالی است
- ادامه خرید
ایمونوفلورسانس-ایمونو هیستوشیمی-ایمونو سیتوشیمی
ایمونوفلورسانس (IF)، ایمونوهیستوشیمی (IHC) و ایمونوسیتوشیمی (ICC)
این تکنیکها بر اساس اتصال اختصاصی آنتیبادی-آنتیژن کار میکنند و امکان
مکانیابی پروتئینهای هدف در داخل سلول یا بافت-شناسایی و مطالعه بیان پروتئینها را فراهم میکنند.
IHC: برشگیری از بافت، چسباندن روی لام، Deparaffinization (برای نمونههای FFPE)
ICC/IF: چسباندن سلولها روی لام (با استفاده از Chamber Slide یا سلسیت)، تثبیت (Fixation)
مرحله ۲: تثبیت (Fixation)
استفاده از فرمالین ۱۰% یا پارافرمالدئید ۴% (PFA)
هدف: حفظ ساختار سلولی و جلوگیری از تخریب
مرحله ۳: نفوذپذیرسازی (Permeabilization)
استفاده از Triton X-100 یا Tween-20
هدف: ایجاد سوراخ در غشاء برای ورود آنتیبادی
مرحله ۴: Blocking
استفاده از BSA یا سرم طبیعی
هدف: جلوگیری از اتصال غیراختصاصی آنتیبادی
مرحله ۵: انکوباسیون با آنتیبادی
آنتیبادی اولیه (اختصاصی برای آنتیژن هدف)
آنتیبادی ثانویه (متصل به آنتیبادی اولیه + کونژوگه با آنزیم یا فلوروفور)
مرحله ۶: رنگآمیزی و آشکارسازی
IHC: استفاده از سوبسترای آنزیمی (DAB) که ایجاد رنگ قهوهای میکند
IF/ICC: استفاده از فلوروفور (FITC, TRITC, Alexa Fluor)
مرحله ۷: مشاهده
IHC: میکروسکوپ نوری-IF/ICC: میکروسکوپ فلورسانس
نکات کلیدی برای موفقیت بهینهسازی غلظت آنتیبادی کنترلهای مثبت و منفی اجتناب از خشک شدن نمونه محافظت از فلوروفورها در برابر نور
لوازم و مواد مصرفی مورد نیاز
۱. مواد عمومی
لام و لامل-پارافرمالدئید ۴% (برای تثبیت)-BS بافر (برای شستشو)-BSA (برای blocking)-Triton X-100 (برای نفوذپذیرسازی)
۲. آنتیبادیها
آنتیبادی اولیه (مثلاً Anti-MAP2 برای نورونها)-آنتیبادی ثانویه کونژوگه با:آنزیم (HRP, AP) برای IHC-فلوروفور (FITC, TRITC, Alexa Fluor) برای IF/ICC
۳. کیتهای رنگآمیزی
کیت DAB (برای IHC)-کیتهای فلورسانس (برای IF/ICC)
۴. مواد Mounting
Mounting Medium حاوی DAPI (برای رنگآمیزی هسته)
۵. تجهیزات
هود لامینار-انکوباتور-میکروسکوپ نوری-میکروسکوپ فلورسانس
کاربردهای هر تکنیک:
ایمونوهیستوشیمی (IHC)-پاتولوژی و تشخیص بیماریها (سرطان)-تحقیقات علوم اعصاب
ایمونوسیتوشیمی (ICC)-مطالعه پروتئینهای سلولی-تحقیقات سلولهای بنیادی-ایمونوفلورسانس (IF)-مطالعه کو-لوکالیزاسیون پروتئینها-میکروسکوپ کانفوکال
مزایا و معایب:
IHC ماندگاری بالا، هزینه کم فقط یک مارکر در هر بار ICC ساده، سریع فقط برای سلولهای کشت شده-IF حساسیت بالا، امکان چندرنگآمیزی فوتوبلیچ، هزینه بالا
این تکنیکها از ابزارهای اساسی در تحقیقات بیولوژی سلولی و مولکولی، پاتولوژی و تشخیص پزشکی محسوب میشوند.
