- سبد خرید شما خالی است
- ادامه خرید
وسترن بلات
وسترن بلات چیست؟
وسترن بلات یک تکنیک قدرتمند در زیستشناسی مولکولی برای تشخیص و سنجش پروتئینهای خاص در یک نمونه بیولوژیکی است. این روش ترکیبی از الکتروفورز برای جداسازی پروتئینها و ایمونوبلاتینگ برای شناسایی پروتئین هدف است.
اصول پایه وسترن بلات:
-جداسازی پروتئینها بر اساس وزن مولکولی با الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید
-انتقال پروتئینها از ژل به یک غشا
-شناسایی پروتئین هدف با استفاده از آنتیبادیهای اختصاصی
-تشخیص سیگنال با روشهای شیمیایی یا فلورسانس
این تکنیک یک ابزار استاندارد طلایی در مطالعات پروتئومیکس و تحقیقات زیستپزشکی محسوب میشود که اطلاعات ارزشمندی درباره حضور، اندازه و مقدار پروتئین هدف ارائه میدهد.
مراحل انجام وسترن بلات:
مرحله ۱: آمادهسازی نمونه-لیز سلولها با بافر لایز مناسب-سنجش غلظت پروتئین (برادفورد، BCA)-آمادهسازی نمونه با بافر Loading + حرارت دادن
مرحله ۲: الکتروفورز (SDS-PAGE)-ژل پلی آکریل آمید: ژل Stacking و Separating-بارگذاری نمونه و استانداردهای وزن مولکولی-اجرای الکتروفورز با ولتاژ مناسب
مرحله ۳: انتقال (Blotting)-انتقال پروتئینها از ژل به غشا-روشهای انتقال:
تر (Wet Transfer)-نیمهخشک (Semi-Dry Transfer)-خشک (Dry Transfer)
مرحله ۴: بلاکینگ-پوشاندن sites غیراختصاصی با BSA یا شیر خشک-جلوگیری از اتصال غیراختصاصی آنتیبادی
مرحله ۵: انکوباسیون با آنتیبادی-آنتیبادی اولیه (اختصاصی برای پروتئین هدف)-آنتیبادی ثانویه (کونژوگه با آنزیم)
مرحله ۶: تشخیص (Detection)-افزودن سوبسترا (ECL، CN/DAB)-تصویربرداری با سیستم داکیومنتیشن
ابزار و لوازم اصلی وسترن بلات:
۱. تجهیزات الکتروفورز
سیستم الکتروفورز عمودی (ژل ریختی)-منبع تغذیه (Power Supply)-شکلدهنده ژل (Casting Frame)-شانه (Comb)
۲. مواد الکتروفورز
آکریل آمید/بیس آکریل آمید-SDS (سدیم دودسیل سولفات)
APS (آمونیوم پرسولفات)-TEMED-بافر Running-مارکر وزن مولکولی
۳. سیستم انتقال
کاست انتقال-فوم اسفنجی-کاغذ صافی-غشا: نیتروسلولز یا PVDF
۴. آنتیبادیها
آنتیبادی اولیه-آنتیبادی ثانویه (کونژوگه با HRP یا AP)
۵. مواد بلاکینگ و شستشو
BSA یا شیر خشک-بافر شستشو (TBST، PBST)
۶. سیستم تشخیص
کیت ECL-دستگاه داکیومنتیشن-فیلم رادیوگرافی یا دوربین CCD
۷. مواد عمومی
بافر لایز سلولی-کیت سنجش پروتئین-پیپتهای دقیق-میکروتیوب
کاربردهای وسترن بلات:
۱. تحقیقات پایه
مطالعه بیان پروتئینها-بررسی تغییرات پس از ترجمه
۲. تشخیص پزشکی
تشخیص بیماریهای خودایمنی-شناسایی پروتئینهای ویروسی
۳. کنترل کیفیت
تست خلوص پروتئینهای نوترکیب-بررسی بیان پروتئین در بیوراکتور
