اصول پایه الایزا

این تکنیک بر اساس:

اتصال آنتی‌ژن-آنتی‌بادی-استفاده از آنزیم‌ها به عنوان نشانگر-سوبسترای آنزیمی که تولید سیگنال رنگی می‌کند-سنجش شدت رنگ با اسپکتروفتومتر

انواع مختلف الایزا:

۱. الایزا مستقیم (Direct ELISA)

آنتی‌بادی کونژوگه با آنزیم مستقیماً به آنتی‌ژن متصل می‌شود

مزایا: سریع، حداقل مرحله

معایب: حساسیت کم

۲. الایزا غیرمستقیم (Indirect ELISA)

آنتی‌بادی اولیه به آنتی‌ژن متصل شده

آنتی‌بادی ثانویه کونژوگه با آنزیم به آنتی‌بادی اولیه متصل می‌شود.

مزایا: حساسیت بالا، تقویت سیگنال

۳. الایزا ساندویچی (Sandwich ELISA)

آنتی‌بادی کپچر روی پلیت کووت شده

آنتی‌ژن به آنتی‌بادی کپچر متصل می‌شود

آنتی‌بادی دیتکت کونژوگه با آنزیم به آنتی‌ژن متصل می‌شود.

مزایا: حساسیت بسیار بالا، اختصاصی بودن

۴. الایزا رقابتی (Competitive ELISA)

آنتی‌ژن نمونه با آنتی‌ژن کونژوگه با آنزیم برای اتصال به آنتی‌بادی رقابت می‌کند

مزایا: مناسب برای آنتی‌ژن‌های کوچک

لوازم و مواد مصرفی مورد نیاز برای الایزا:

۱. پلیت الایزا

۹۶ چاهکی (گاهی ۳۸۴ چاهکی)

جنس: پلی استایرن با قابلیت اتصال پروتئین

انواع: کیت‌های آماده یا پلیت خام

۲. آنتی‌بادی‌ها

آنتی‌بادی کپچر (برای ساندویچ)-آنتی‌بادی دیتکت (کونژوگه با آنزیم)

استانداردهای آنتی‌ژن

۳. بافرها:

بافر کوتینگ (Carbonate-Bicarbonate)-بافر بلوکینگ (BSA، سرم، Casein)-بافر شستشو (PBS + Tween-20)-بافر رقیق‌کننده

۴. آنزیم‌ها و سوبستراها

آنزیم‌های رایج:

HRP (Horseradish Peroxidase)

AP (Alkaline Phosphatase)

سوبسترای HRP:

TMB (Tetramethylbenzidine) – آبی رنگ

OPD (Ortho-Phenylenediamine) – نارنجی رنگ

سوبسترای AP:

PNPP (p-Nitrophenyl Phosphate) – زرد رنگ

۵. محلول توقف واکنش

اسید سولفوریک (برای TMB)-سدیم هیدروکسید (برای PNPP)

۶. تجهیزات

اسپکتروفتومتر/ردر الایزا (با فیلتر ۴۵۰ نانومتر)-شیکر الایزا-واتر باتل شستشو (اتوماتیک یا دستی)-پیپت‌های چندکاناله-انکوباتور (دمای ۳۷°C)

مراحل انجام الایزا(ساندویچی):

مرحله ۱: کوتینگ

اضافه کردن آنتی‌بادی کپچر به پلیت-انکوباسیون overnight در ۴°C

مرحله ۲: بلوکینگ

اضافه کردن بافر بلوکینگ برای پر کردن sites خالی-انکوباسیون ۱-۲ ساعت در ۳۷°C

مرحله ۳: اضافه کردن نمونه

اضافه کردن نمونه و استانداردها-انکوباسیون ۱-۲ ساعت در ۳۷°C

مرحله ۴: اضافه کردن آنتی‌بادی دیتکت

شستشو + اضافه کردن آنتی‌بادی کونژوگه با آنزیم-انکوباسیون ۱ ساعت در ۳۷°C

مرحله ۵: اضافه کردن سوبسترا

شستشو + اضافه کردن سوبسترای آنزیمی-انکوباسیون ۱۵-۳۰ دقیقه در تاریکی

مرحله ۶: توقف واکنش

اضافه کردن محلول استاپ-خواندن جذب در اسپکتروفتومترا