اصول پایه ریل تایم PCR:

سنجش فلورسانس در هر سیکل-رابطه مستقیم بین شدت فلورسانس و مقدار DNA-محاسبه مقدار اولیه DNA بر اساس سیکل آستانه (Ct)-دقت بالا در سنجش‌های کمی

انواع ریل تایم PCR:

۱. بر اساس روش تشخیص:

SYBR Green: اتصال به DNA دو رشته‌ای-TaqMan Probe: استفاده از پروب اختصاصی-Molecular Beacons: پروب‌های سنجاق سری-Scorpion Primer: پرایمر-پروب ترکیبی

۲. بر اساس کاربرد:

سنجش کمی (qPCR): اندازه‌گیری مقدار DNA/RNA

RT-qPCR: سنجش RNA با تبدیل به cDNA-مطالعه بیان ژن: سنجش mRNA-تشخیص پزشکی: شناسایی پاتوژن‌ها

ابزار و لوازم اصلی ریل تایم PCR:

۱. دستگاه ریل تایم PCR

بلاک حرارتی با قابلیت کنترل دقیق دما-منبع نور (LED، لیزر)-دتکتور فلورسانس-نرم‌افزار تحلیل داده

۲. کیت‌های ریل تایم PCR

میکس واکنش (Master Mix)-پرایمرها (اختصاصی برای ژن هدف)-پروب‌ها (برای روش TaqMan)-کنترل‌های مثبت و منفی

۳. مواد مصرفی

پلیت‌های ۹۶ چاهکی یا استریپ تیوب‌ها-Optical Seal-نوک پیپت فیلتردار-لوله‌های میکروسانتریفیوژ

۴. معرف‌ها و استانداردها

استانداردهای غلظت مشخص-SYBR Green Master Mix

TaqMan Master Mix-کنترل‌های داخلی

۵. تجهیزات جانبی

سانتریفیوژ پلیت-پیپت‌های دقیق-هود لامینار-فریزر ۲۰- درجه

مراحل انجام ریل تایم PCR:

مرحله ۱: طراحی پرایمر و پروب

طراحی اختصاصی برای ژن هدف-بهینه‌سازی دمای اتصال-تست اختصاصی بودن

مرحله ۲: استخراج RNA/DNA

استخراج با کیفیت بالا-سنجش خلوص و غلظت-سنتز cDNA (برای RT-qPCR)

مرحله ۳: آماده‌سازی واکنش

تهیه مخلوط واکنش-اضافه کردن نمونه‌ها-سری‌رقت استاندارد

مرحله ۴: اجرای برنامه

Stage 1: فعال سازی آنزیم (۹۵°C)

Stage 2: سیکل‌های PCR (۴۰-۴۵ سیکل)

Stage 3: منحنی ذوب (برای SYBR Green)

مرحله ۵: تحلیل داده

تعیین Ct values-محاسبه تغییرات بیان-آنالیز آماری